Clonagem e expressão de genes relacionados com a biossíntese de NAD e FAD de Mycoplasma hyopneumoniae

Abstract

Bactérias do gênero Mycoplasma compreendem um grupo de mais de 200 espécies que se caracterizam principalmente por seu tamanho diminuto, ausência de parede celular e por serem parasitas obrigatórios de uma ampla gama de organismos incluindo humanos, plantas e animais. A espécie Mycoplasma hyopneumoniae encontra-se normalmente associada a suínos, causando uma doença respiratória denominada pneumonia enzoótica suína, que caracteriza-se por ser crônica porém não muito severa, podendo se agravar por infecções oportunistas de outras bactérias, gerando grandes perdas econômicas às indústrias suinícolas. Neste trabalho 3 genes que codificam proteínas anotadas como hipotéticas (MHP7448_0278, MHP7448_0394 e MHP7448_0476), e que revelaram a presença de motivos proteicos relacionados a atividades metabólicas, como a rota de biossíntese de FAD e NAD, respectivamente, foram selecionados, amplificados por PCR e clonados em vetores de expressão de Escherichia coli. A expressão, solubilidade e rendimento das proteínas recombinantes foram analisados. A clonagem com o gene MHP7448_0394 resultou em uma colônia recombinante. Para o gene MHP7448_0278 três colônias recombinantes foram obtidas e para o gene MHP7448_0476 a clonagem ainda não foi bem sucedida. A expressão ocorreu em linhagens de E. coli BL21 e foi induzida com a adição de IPTG. As melhores linhagens para a expressão da proteína codificada pelo gene MHP7448_0394 foram E. coli BL21 (DE3) pLysE e E. coli BL21 (DE3) Star, e para a proteína codificada pelo gene MHP7448_0278 as melhores cepas foram E. coli BL21 (DE3) pLysE e E. coli BL21 (DE3) CodonPlus Rill. O teste de solubilidade proteica foi realizado nas duas melhores linhagens de expressão de MHP7448_0394 e ambas mostraram a proteína na sua fração solúvel em condições padrões de indução, sendo então purificada a partir de cromatografia de afinidade. A proteína codificada pelo gene MHP7448_0278 mostrou-se insolúvel nas condições padrões. As proteínas purificadas terão suas estruturas analisadas e função caracterizada.

Bacteria from Mycoplasma’s genus comprise a group of more than 200 species that are characterized mainly by their diminutive size, lack of cell wall and by their obligate parasites’ lifestyle of a wide range of organisms including humans, plants and animals. The species Mycoplasma hyopneumoniae is usually associated with pigs, causing a respiratory disease denominate swine enzootic pneumonia, which is characterized as chronic but not severe, and could be worsen by opportunistic infections of other bacteria, causing great economic losses to swine industries. In this work 3 genes that encodes for proteins annotated as hypothetical (MHP7448_0278, MHP7448_0394 and MHP7448_0476), which revealed the presence of protein motifs related to metabolic activities, such as the route of NAD and FAD biosynthesis, respectively, were selected, amplified by PCR and cloned into Escherichia coli expression vectors. Recombinant protein expression, solubility and yields were analyzed. The MHP7448_0394 gene cloning resulted in one recombinant colony. For the gene MHP7448_0278 three recombinant colonies were obtained, and for the MHP7448_0476, gene cloning has not yet been successful. The expression occurred in strains of E. coli BL21 and was induced with the addition of IPTG. The best strains for the protein encoded by the MHP7448_0394 gene were E. coli BL21 (DE3) pLysE and E. coli BL21 (DE3) Star and the protein encoded by the gene MHP7448_0278 the best strains are E. coli BL21 (DE3) pLysE and E. coli BL21 (DE3) CodonPlus Rill. The protein solubility test was conducted on the two best strains of MHP7448_0394 expression and both showed protein in the soluble fraction in standards induction conditions, that was then purified from affinity chromatography. The MHP7448_0278 gene protein proved to be insoluble under standards conditions. The purified proteins will have its structures reviewed and featured function analyzed.