Padronização da expressão do complexo ribonucleoprotéico sgRNA:Cas9 em Escherichia Coli e avaliação da atividade inativadora de genes alvo em fungos entomopatogênicos

Abstract

Considerado um organismo modelo para o estudo das interações patógeno-hospedeiro, Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso entomopatogênico amplamente utilizado no controle biológico de pragas. A caracterização de funções gênicas com a construção de mutantes nulos é uma das abordagens mais utilizadas para descrever os mecanismos de infecção de microrganismos. Entretanto, a geração de mutantes funcionais utilizando os métodos moleculares de geração de mutantes nulos por recombinação homóloga apresenta baixa eficiência em fungos filamentosos. Com o advento da era genômica, novas metodologias de edição de DNA vêm sendo testadas, dentre elas ganha notoriedade o sistema CRISPR, desenvolvido a partir de mecanismos moleculares do sistema imunológico bacteriano, no qual um RNA guia ligado à uma endonuclease direciona a clivagem do DNA alvo. Portanto, o presente estudo propõe avaliar a participação do gene ChiMaD4 da família das quitinases, subgrupo D, na virulência de M. anisopliae a partir da construção de mutantes nulos do fungo utilizando do sistema CRISPR/Cas9. Para isso, foram construídos cassetes de inativação do locus do gene ChiMaD4, que foi clonado no vetor binário pPZP201BK, gerando os vetores pPZP201BK::ΔChiMaD4Bar e pPZP201BK::ΔChiMaD4Sur. Utilizando polietilenoglicol, foi realizada a transfecção dos protoplastos de M. anisopliae pelo sistema CRISPR. A utilização desse sistema para a geração de mutantes nulos se mostra como uma potencial solução para o aumento das taxas de recombinação. Contudo, observamos em nossos experimentos que a regeneração dos protoplastos transformados não ocorreu provavelmente devido a adaptações nos protocolos de transfecção entre diferentes microrganismos, o que evidencia a dificuldade de implementação de novas metodologias em organismos mais complexos. Avaliando os resultados obtidos a partir desse trabalho novas tentativas de geração de mutantes funcionais serão realizadas, utilizando diferentes protocolos a fim de estabelecer uma metodologia eficaz para o uso de CRISPR/Cas em fungos filamentosos.

Considered a model organism for the study of pathogen-host interactions, Metarhizium anisopliae is a species of entomopathogenic filamentous fungus widely used in the biological control of pests. The characterization of gene functions by the construction of null mutants is one of the most used approaches to describe the infection mechanisms of microorganisms. However, the generation of functional mutants using classical molecular methods of cloning, such as homologous recombination, presents low efficiency in filamentous fungi since non-homologous recombination is the main repair pathway of the DNA. With the advent of the genomic era, new DNA editing methodologies have been tested, such as the CRISPR system, developed from molecular mechanisms of the bacterial immune system, in which a guide RNA linked to an endonuclease directs the cleavage of the target DNA. Therefore, the present study proposes to evaluate the participation of the ChiMaD4 gene, prospected from the D subgroup of the chitinase family, in the virulence of M. anisopliae from the construction of null mutants of the fungus using the CRISPR/Cas9 system as a transformation method. For this, deletion cassettes were constructed to interrupt the ChiMaD4 gene locus, which was cloned into the pPZP201BK binary vector, generating the pPZP201BK::ΔChiMaD4Bar and pPZP201BK::ΔChiMaD4Sur vectors. Using polyethylene glycol, the transfection of M. anisopliae protoplasts by the CRISPR system was carried out. The use of this system for the generation of null mutants is shown as a potential solution to increase recombination rates. However, we observed in our experiments that the regeneration of transformed protoplasts probably did not occur due to adaptations in the transfection protocols between different microorganisms, which highlights the difficulty of implementing new methodologies in more complex organisms. Evaluating the results obtained from this work, new attempts to generate functional mutants will be performed, using different protocols in order to establish an effective methodology for the use of CRISPR/Cas in filamentous fungi.