Revisão das principais técnicas e proposição de metodologia para produção heteróloga da proteína inibidora de tripsina do tipo kunitz, rica em metioninas (KTIMet), derivada de soja [Glycine max (L.) Merrill] em Escherichia coli

Abstract

A expressão heteróloga de genes em microrganismos é ferramenta importante da biotecnologia pois representa ciclo produtivo mais rápido, econômico e eficaz quando comparado a métodos para obtenção das proteínas codificadas a partir dos organismos de origem. No entanto, a diversidade de técnicas disponíveis na literatura evidencia a necessidade de utilizar critérios para a seleção do sistema de expressão microbiano mais adequado em cada caso. Neste trabalho, foram estudados alguns dos métodos descritos na literatura científica e apresentados os critérios que permitiram a seleção da metodologia proposta. Para exemplificar as escolhas realizadas durante a elaboração desta monografia, foi utilizada uma proteína recombinante concebida em estágios de graduação e durante o trabalho de mestrado do autor. Trata-se da denominada KTIMet, versão sintética de um inibidor de tripsina do tipo Kunitz enriquecida em metioninas originalmente derivada de soja [Glycine max (L.) Merrill]. As principais considerações para a definição da melhor metodologia de produção de KTIMet foram: (I) viabilidade da síntese de proteína recombinante enriquecida em metioninas por bactérias; (II) viabilidade da expressão heteróloga de gene codificador de proteína vegetal inibidora de protease em bactérias; e (III) testar a hipótese levantada em análise in silico quanto à redução da atividade inibitória em comparação com a proteína nativa. Foram, assim, propostos métodos para a expressão gênica em Escherichia coli, a extração de proteínas e a purificação de KTIMet. Esta monografia poderá auxiliar na continuidade das pesquisas referentes à esta proteína, validando os pressupostos originais relacionados às vantagens de sua incorporação no conjunto de proteínas da soja quanto aos ganhos nutricionais deste grão, os quais são de grande relevância econômica no cenário da indústria de alimentos.

The heterologous expression of genes in microorganisms is an important tool in biotechnology because it represents a faster, more economical and more efficient production cycle when compared to methods for obtaining encoded proteins from the original organisms. However, the diversity of techniques available in the literature highlights the need to use criteria for selecting the most appropriate microbial expression system in each case. In this work, some of the methods described in the scientific literature were studied and the criteria that allowed the selection of the proposed methodology were presented. To exemplify the choices made during the preparation of this monograph, a recombinant protein designed in undergraduate stages and during the author's master's work was used. This is the so-called KTIMet, a synthetic version of a Kunitz-type trypsin inhibitor enriched in methionines originally derived from soy [Glycine max (L.) Merrill]. The main considerations for defining the best methodology for producing KTIMet were: (I) viability of the synthesis of recombinant protein enriched in methionines by bacteria; (II) viability of heterologous expression of the gene coding for a protease inhibitor plant protein in bacteria; and (III) test the hypothesis raised in an in silico analysis regarding the reduction of the inhibitory activity compared to the native protein. Thus, methods for gene expression in Escherichia coli, protein extraction and purification of KTIMet were proposed. This monograph will be able to help in the continuity of the research related to this protein, validating the original assumptions related to the advantages of its incorporation in the pool of soy proteins regarding the nutritional gains of this grain, which are of great economic relevance in the food industry scenario.