Tailoring chitosan-genipin complex for β-galactosidase immobilization : porosity modification, structure characterization, and bioprocessing applications

Abstract

A imobilização de enzimas é uma técnica capaz de aumentar sua estabilidade e capacidade de reuso. O uso do complexo quitosana-genipina (CH-GE) como material de suporte para imobilização enzimática torna-se bastante atrativo, pois o entrecruzamento aumenta a estabilidade mecânica do polímero e permite a formação de uma rede polimérica complexa que possui alta afinidade por proteínas. Neste sentido, o presente trabalho buscou modificar a porosidade da estrutura de esferas de quitosana, entrecruzar com genipina e aplicar as esferas para imobilizar a β-galactosidase (E) de Aspergillus oryzae e assim, poder aplicar o biocatalisador resultante na hidrólise de lactose e na produção de galactooligossacarídeos (GOS). Para isso, foi aplicado o Na2CO3 como agente porogênico para induzir a formação de poros na matriz polimérica de esferas de quitosana, depois, foram entrecruzadas com genipina e usadas para a imobilização da enzima, gerando dois biocatalisadores, um não modificado, CH-GE-E, e outro modificado, PCH-GE-E (adicionado de Na2CO3). Os biocatalisadores foram caracterizados por métodos convencionais e não convencionais, como espalhamento de raios-X a baixo ângulo, adsorção de corantes, microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de varredura, força de compressão, adsorção/dessorção de N2 e análise termogravimétrica. Os resultados constataram a modificação da porosidade do suporte, apresentando poros maiores e mais interconectados, o que também diminuiu sua resistência à deformação. A microestrutura também foi modificada, aumentando a fractalidade, especialmente a maiores escalas (~100 nm) e diminuindo-a a menores escalas (~1-10 nm). Além disso, os biocatalisadores foram aplicados em reatores de leito fixo e o PCH-GE-E demonstrou uma melhor estabilidade operacional na produção de GOS durante 30 dias. A seguir, o processo de imobilização da enzima em suporte de quitosana e genipina foi estudado mais detalhadamente. A β-galactosidase de A. oryzae foi imobilizada no suporte PCH-GE usando quatro diferentes pH (4,5, 6,0, 7,5 e 9,0), obtendo-se assim quatro biocatalisadores: B4, B6, B7 e B9. Os biocatalisadores foram caracterizados quanto às suas estabilidades térmica, ao pH e ao armazenamento. Ainda, foi estudada a estabilidade operacional para a hidrólise de lactose em reatores contínuos e batelada. Foi encontrado que os quatro biocatalisadores apresentaram estabilidade térmica superior à enzima livre a 55 °C. Os biocatalisadores preparados em condições alcalinas tiveram melhor desempenho no meio ácido e os biocatalisadores preparados em condições ácidas mostraram maior estabilidade no meio alcalino. Além disso, mantiveram pelo menos 95% da sua atividade inicial, após 20 semanas armazenados a 4 °C. Por último, quando aplicados durante 50 ciclos para a hidrólise de lactose, todos mantiveram pelo menos 71% da sua atividade inicial, destacando o B6, que manteve quase o 100%. Por outro lado, no processo contínuo, após 20 dias, todos os biocatalisadores demonstraram alta estabilidade e produtividade, destacando o B6 que inclusive aumentou sua produtividade de 41,3 a 48,1 g L-1 h-1, mantendo 78.1% da sua atividade inicial. Assim, pode se concluir que os biocatalisadores obtidos melhoraram a estabilidade da enzima e o complexo quitosana-genipina possui um grande potencial para aplicação não apenas como suporte para imobilização enzimática, mas também para aplicação em outras áreas devido à suas propriedades plásticas e dinâmicas, além de ser uma alternativa sustentável e ambientalmente amigável.

Enzyme immobilization is a technique capable of increasing their stability and reusability. The use of the chitosan-genipin complex (CH-GE) as a support material for enzyme immobilization becomes highly attractive because crosslinking enhances the mechanical stability of the polymer and allows the formation of a complex polymeric network with high affinity for proteins. In this regard, the present study aimed to modify the porosity of chitosan sphere structures, crosslink them with genipin, and apply the spheres to immobilize β-galactosidase (E) from Aspergillus oryzae, thus enabling the application of the resulting biocatalyst in lactose hydrolysis and galactooligosaccharides (GOS) production. To achieve this, Na2CO3 was used as a porogenic agent to induce pore formation in the chitosan sphere polymer matrix. Subsequently, the spheres were crosslinked with genipin and used for enzyme immobilization, resulting in two biocatalysts: one unmodified (CH-GE-E) and one modified (PCH-GE-E, with added Na2CO3). The biocatalysts were characterized using conventional and unconventional methods such as low-angle X-ray scattering, dye adsorption, atomic force microscopy, scanning electron microscopy, compression force, N2 adsorption/desorption, and thermogravimetric analysis. The results revealed modification of the support's porosity, showing larger and more interconnected pores, which also reduced its deformation resistance. The microstructure was also modified, increasing fractality, particularly at larger scales (~100 nm), and decreasing it at smaller scales (~1-10 nm). Additionally, the biocatalysts were applied in fixed-bed reactors, with PCH-GE-E demonstrating better operational stability in GOS production over 30 days. Subsequently, the enzyme immobilization process on the chitosan-genipin support was further studied in detail. β-galactosidase from A. oryzae was immobilized on the PCH-GE support using four different pH values (4.5, 6.0, 7.5, and 9.0), resulting in four biocatalysts: B4, B6, B7, and B9. The biocatalysts were characterized for their thermal stability, pH stability, and storage stability. Furthermore, operational stability was studied for lactose hydrolysis in continuous and batch reactors. It was found that all four biocatalysts exhibited superior thermal stability compared to free enzyme at 55 °C. Biocatalysts prepared under alkaline conditions performed better in acidic environments, while those prepared under acidic conditions showed greater stability in alkaline environments. Moreover, they retained at least 95% of their initial activity after 20 weeks of storage at 4 °C. Finally, when applied for 50 cycles in lactose hydrolysis, all biocatalysts maintained at least 71% of their initial activity, with B6 standing out, retaining nearly 100% of its activity. On the other hand, in the continuous process, after 20 days, all biocatalysts demonstrated high stability and productivity, with B6 showing an increase in productivity from 41.3 to 48.1 g L-1 h-1 while retaining 78.1% of its initial activity. Thus, it can be concluded that the obtained biocatalysts improved the enzyme's stability, and the chitosan-genipin complex has great potential for application not only as a support for enzyme immobilization but also in other areas due to its plastic and dynamic properties, making it a sustainable and environmentally friendly alternative.