Estudo funcional da quitinase ChiMaA4 do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae

Abstract

Metarhizium anisopliae é um fungo filamentoso que infecta uma ampla diversidade de hospedeiros artrópodes. A infecção ocorre pela penetração direta através da cutícula do hospedeiro que é composta por quitina. As quitinases são uma das famílias de hidrolases que estão envolvidas na dissolução do exoesqueleto quitinoso dos hospedeiros. Nos fungos estas enzimas estão envolvidas em morfogênese e nutrição. Análises de genomas mostram que entre 10 e 35 genes de quitinases estão presentes em fungos filamentosos. A análise in silico do genoma da linhagem E6 de M. anisopliae identificou 24 genes que provavelmente codificam para quitinases. As quitinases propostas foram categorizadas em quatro subgrupos de acordo com a sua proximidade filogenética e organização estrutural. Apesar do número de quitinases já isoladas ou descritas em fungos leveduriformes e filamentosos ser amplo, estudos envolvendo a descrição exata da função dessas quitinases ainda são escassos. Estudos anteriores do grupo mostraram que o gene que codifica ChiMaA4 apresenta níveis de transcritos similares em diferentes tipos celulares (conídio, hifa, apressório, blastosporo) e sob diferentes meios de cultivo: meio rico (MCc), GlcNAc (0,25%) ou quitina 1%. Nosso objetivo é a caracterização da função desta quitinase pela construção de mutantes funcionais para a quitinase ChiMaA4 e caracterização das alterações fenotípicas resultantes dessa deleção. Foi utilizada a metodologia de geração de mutantes mediada por Agrobacterium tumefaciens. A construção para a deleção da quitinase ChiMaA4 foi efetuada pela técnica de PCR de sobreposição (overlapping). O estudo realizado contribuirá para elucidar a função desta quitinase na fisiologia do M. anisopliae.

Metarhizium anisopliae is a filamentous fungus that infects a wide variety of artrophode hosts. The infection occurs by means of the direct penetration though the cuticle of the host that is formed by chitin. The chitinases are one of the hydrolase family that are involved in the dissolution of the chitin exoskeleton of the hosts. In fungi, these enzymes are involved in morfogenesis and nutrition. Genome analysis shows that about 10 to 35 chitinase genes are present in filamentous fungi. M. anisopliae in silico genome analysis, identified 24 putative genes coding for chitinases. The proposed chitinases were categorized into 4 subgroups according to it’s filogenetic proximity and structural organization. Despite the wide number of chitinases already isolated or described in yeast and filamentous fungi, studies involving the precise function of these chitinases are still rare. Previous studies have shown that M. anisopliae E6 chimaA4 gene has similar transcript levels in different cell types (e.g. conidia, hypha, apressorium, yeast-like blastospores) and under different substrates: rich medium (MCc), GlcNAc (0.25%) or chitin 1%. Our goal is to characterize the function of this chitinase by the construction of functional mutants for chitinase ChiMaA4 and analysis of the phenotypic changes resulting from this deletion. The mutants have been accomplished by a technique using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation. The construction for deletion of chitinase ChiMaA4 has been accomplished by the overlapping PCR technique. This study will help to better understand the function of this chitinase in the physiology of M. anisopliae.