Protocolo para resfriamento de embriões de Zebrafish durante até 12 horas

Abstract

As técnicas de criopreservação e resfriamento de gametas e embriões têm atuado como importantes ferramentas na preservação de diversas espécies aquáticas, cuja necessidade de medidas que atendam suas condições específicas é crescente. Atualmente, diversos protocolos estão sendo testados na tentativa de elencar a melhor forma de conservação de embriões de peixes teleósteos. O transporte de material genético entre laboratórios e estabelecimentos contribuirá diretamente com as pesquisas, estabelecendo linhagens genéticas específicas e auxiliando na conservação de espécies. O Zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental muito utilizado, por ter transparência embrionária e facilitar análises e estudos por observação ocular, dando acesso a circulação e transporte de substâncias. O objetivo desse trabalho é otimizar um protocolo para resfriamento de embriões de zebrafish (Danio rerio), considerando aspectos como taxa de eclosão e comportamento larval, contribuindo com sua preservação, bem como o estudo do resfriamento em embriões de peixes e biotecnologias de transporte de embriões. Utilizando a proporção de 2 fêmeas para cada macho (2F:1M) a reprodução foi induzida, e os embriões coletados. Na condição de 50% de Epibolia (n=20) era feita a distribuição em três soluções (1M Metanol + 0,1M Sacarose, PBS e Água de Incubação), e controle, contendo 40 ml por Falcon em três tempos de resfriamento (6, 12 e 24 horas), posteriormente reaquecidos e incubados a 28,3°C ± 0,8 em Placas Petri com 25 mL de água de incubação para as análises até da abertura de boca, onde foram avaliadas taxas de batimento cardíaco, taxa de eclosão e retardo. Em 96 horas pós-fecundação, as larvas eram levadas para aquários, para análises comportamentais, sobrevivência e deformidade, ficando nesta condição até o final do experimento em 15 dias pós- fecundação. O tratamento 1M Metanol + 0,1M Sacarose alcançou 12 horas de resfriamento com as mesmas taxas de eclosão que o controle. Porém, o tratamento com crioprotetor também revelou um aumento considerável no batimento cardíaco por minuto (bpm) dos embriões, o que reduziu o tempo de retardo causado pelo resfriamento. As taxas de deformidade e sobrevivência também revelaram que 1M Metanol + 0,1M Sacarose não possuem diferença estatística com o controle por até 12 horas de resfriamento. Os embriões mantidos por 24 horas de resfriamento não suportaram. O protocolo pode ser utilizado como peça fundamental para comercialização/ compartilhamento de linhagens genéticas específicas de Zebrafish, por até 12 horas, auxiliando na pesquisa farmacológica e avanço da pesquisa científica. O trabalho realizado abre portas para estudos que podem ser realizados visando produzir novas tecnologias para o transporte econômico e viável de embriões de peixes.

The techniques of cryopreservation and cooling of gametes and embryos have acted as important tools in the preservation of divers aquatic species, whose need for measures that meet their specific conditions is increasingly increasing. Currently, manifold protocols are being tested in an attempt to list the best way to conserve teleosseous fish embryos. The transport of genetic material between laboratories and establishments will contribute directly to research, establishing specific genetic lineages and assisting in the conservation of species. The Zebrafish (Danio rerio) is a widely used experimental model, because it has embryonic transparency and facilitates analysis and studies by ocular observation, giving access to circulation and transport of substances. The objective of this work is to optimize a protocol for cooling zebrafish (Danio rerio) embryos, considering aspects such as hatching rate and larval behavior, contributing to its preservation, as well as the study of cooling in fish embryos and biotechnologies for embryos transport. Using the ratio of 2F:1M, reproduction was induced, and the embryos were collected. In the condition of 50% of Epibolia (n=20) was made the distribution in three solutions (1M Methanol + 0.1M Sucrose, PBS and Incubation Water), and control, containing 40ml by Falcon in three cooling times (6, 12 and 24 hours), later reheated and incubated at 28.3°C ± 0.8 in Petri dishes with 25mL of incubation water for the analyses until the mouth opening, where heartbeat rates, hatch rate and delay were evaluated. In 96 hours after fertilization, the larvae were taken to aquariums for behavioral analysis, survival and deformity, remaining in this condition until the end of the experiment in 15 days post-fertilization. The 1M Methanol + 0.1M Sucrose treatment achieved 12 hours of cooling with the same hatch rates as the control. However, the treatment with cryoprotector also revealed a considerable increase in the heart rate per minute (bpm) of the embryos, which ended up reducing the delay time caused by cooling. The deformity and survival rates also revealed that 1M Methanol + 0.1M Sucrose have no statistical difference with the control for up to 12 hours of cooling. The embryos kept for 24 hours of cooling did not endure. The protocol can be used as a fundamental piece for commercialization / sharing of specific genetic strains of Zebrafish, for up to 12 hours, assisting in pharmacological research and advancement of scientific research. The work carried out opens the door to studies that can be carried out to produce new technologies for the economic and viable transport and embryos of fish.