Caracterização enzimática de uma aspártico protease recombinante do carrapato Boophilus microplus produzida na forma ativa em Escherichia coli

Abstract

O carrapato Boophilus microplus, um ectoparasita hematófago, é responsável por perdas econômicas substanciais na bovinocultura, necessitando o uso intensivo de acaricidas em várias partes do mundo. Problemas com os resíduos químicos presentes na carne e no leite, o custo dos acaricidas e a seleção de populações de carrapato resistentes, têm estimulado o desenvolvimento de métodos de controle alternativos não-químicos. O controle imunológico, por meio de vacinas, e considerado o um dos métodos mais promissores, no entanto, seu desenvolvimento depende da identificação de moléculas do carrapato e caracterização de seus papéis na fisiologia desse artrópode. Recentemente foi descrito que o B. microplus obtém suas moléculas de heme da hemoglobina do hospedeiro presente no sangue ingerido, sendo o primeiro organismo multicelular descrito que é incapaz de sintetizar o anel de ferro protoporfirina IX. Um importante resultado dessa descoberta, no contexto da reprodução do carrapato, é que os ovos devem conter todo o heme necessário para constituir um novo organismo. Assim, as vitelinas, principais proteínas do vitelo, além de constituírem a principal fonte de aminoácidos, fornecem o heme necessário para o desenvolvimento do embrião. A disponibilidade dessa fonte depende de várias enzimas proteolíticas, entre elas a THAP (Tick Heme-binding Aspartic Proteinase). Estudos com essa enzima mostraram que ela possui um sitio de ancoragem que reconhece heme na superfície do substrato protéico aumentando assim sua especificidade para hemeproteínas e promovendo um mecanismo de controle do estresse oxidativo. Percebendo sua importância na embriogênese do carrapato, nós realizamos a subclonagem da sequência codificante completa da THAP após a recuperação dos doze nucleotídeos iniciais que estavam ausentes no cDNA inicialmente clonado. Através de PCR, obtivemos um amplicon de 1065 pb que foi clonado no vetor de expressão pET43a. O plasmídeo resultante (pET43a- THAP4aa) fol eletroporado em nove linhagens de E.coli BL21(DE3). As melhores condições estabelecidas para a produção da proteina recombinante (THAP associada a proteína de fusão Nus-Tag) na forma solúvel foi a expressão em E.coli BL21(DE3) RIL a 23° C por 4 horas com 1 mM de IPTG. A análise da expressão foi realizada por SDS-PAGE e Western-blot com soro policlonal ant-THAP nativa. A THAP recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade em resina Sepharose-Ni²⁺. Uma fração parcialmente purificada e hidrolisada para remoção da proteína de fusão foi utilizada na realização de ensaios enzimáticos com substrato sintético fluorogênico. A atividade específica obtida sobre substrato sintético foi de 2,267 RFU/ min/ mg de proteína. Essa atividade foi inibida por pepstatina A, mas não por E-64, leupeptina ou antipaína. O sucesso da expressão da THAP ativa em E.coli oferece uma vantagem para produção e purificação dessa enzima em larga escala o que pode acelerar investigações adicionais sobre sua atividade enzimática e sobre a estrutura funcional desta enzima. Além disso, a produção de proteínas recombinantes em sistema heterólogo é um processo chave para o desenvolvimento de uma vacina para o eficiente controle do B. microplus, objetivo central do nosso trabalho.

The hard tick Boophilus microplus is responsible for substantial economic losses to the livestock industry, necessitating intensive use of chemical acaricides in many parts of the world. Problems of chemical residues in meat and milk, costs of acaricides, and development of resistance by ticks, have long been recognized and have helped to stimulate interest in tick control by immunological and biological means. An anti-tick vaccine is considered one of the most promising methods; however, its development still depends on the identification of tick molecules and characterization of their roles in arthropod physiology. Recently it was show that B. microplus obtains its own heme from host hemoglobin present in the ingested blood, being the first multicellular organism shown to be unable to synthesize the protoporphyrin ring. An important outcome of this finding, in the context of tick's reproduction, is that the egg must provide all the heme necessary to build up a new organism. Thus, vitellins (VT), the major storage proteins from eggs, are the source of amino acids and heme used for embryo growth in this arthropod. The available of this source is dependent of several proteolytic enzymes, among them an heme-binding aspartic proteinase (THAP). Studies with that enzyme showed that it has a docking site that recognizes heme on the surface of protein substrates increasing its specificity toward hemeproteins and providing a possible mechanism of regulating tick VT degradation preventing oxidative damage. Perceive its importance; we have subcloned the full protein sequence after restoring of the four initial amino acids of the THAP. It was necessary since initial nucleotides of the exon were absent in the original DNA cloned. Through PCR was obtained an amplicon with 1065 bp that was cloned in the pET43a expression vector. The resultant plasmid (pET43a- THAP4aa) was transformed by electroporation in eleven E. coli strains BL21 (DE3). The best conditions established for production of the recombinant protein (THAP with fusion protein Nus-Tag) in the soluble form was the expression in E.coli BL21 (DE3) RIL at 23° C and 1 mM of IPTG for 4 hours. Analysis of the expression was performed by SDS-PAGE and Western-blot using a polyclonal serum anti-THAP. For the purification of THAP-NusTag was used an affinity chromatography column with Sepharose-Ni²⁺. A fraction partially purified was obtained and its enzymatic activity was assayed with fluorogenic substrate Abz-AIAFFSRQ-EDDnp after hydrolysis for removal the fusion protein (Nus-Tag). The enzymatic activity was monitored for 1 hour with F-MAX fluorometer and the specific activity obtained was 2,267 RFU/ min/ mg of protein. Its activity was inhibited by pepstatin A, but not by E-64, leupeptin or antipain. The successful expression of active recombinant THAP in E. coli offers an advantage for production and purification of that enzyme in wide scale that can accelerate additional investigations about its enzymatic activity and functional structure of this enzyme. Besides, the production of recombinant proteins in heterologous systems is a key process to development of an anti-tick vaccine, central objective of our work.