Neonatal intravenous injection of CRISPR/Cas9 liposomal complex has no incidence of off-targets in mice

Abstract

Gene therapy has been increasingly researched for the treatment of diseases and the CRISPR/Cas9 system is considered a highly advanced and specific tool. However, it is necessary to reduce the chances of off-target cleavage, in order to reduce the harmful effects of mutations and chromosomal rearrangements, which may be a side effect of gene editing. Consequently, it is imperative to highlight the need to identify potential off-target cleavage sites that can cause mutagenesis and consequent tumor induction. In this sense, we analyzed off-target site prediction after hydrodynamic injection of liposomes as vectors of the CRISPR/Cas9 system in newborn mice. The overall characterization of formulations showed complexes of about 133 nm, with positive zeta potential of +43 mV. The biodistribution of complexes after hydrodynamic injection was markedly detected in the liver, lungs, and heart, which became the main target tissues of this study. Off-target experimental analysis based on the potential sites obtained from in silico predictions showed 0% of indels in the liver and lungs. We conclude that the set of experiments showed the potential of the chosen gRNA sequence to perform a safe gene editing in the murine ROSA26 locus.

A edição gênica tem sido cada vez mais pesquisada para o tratamento de doenças, sendo o sistema CRISPR/Cas9 considerado uma ferramenta de clivagem de DNA altamente avançada e específica. No entanto, é necessário reduzir as chances de ocorrerem clivagens fora do alvo pretendido, denominados eventos off-target, a fim de evitar os efeitos nocivos de mutações e rearranjos cromossômicos, que podem ser uma consequência dessa edição. Dessa forma, é importante enfatizar a necessidade de identificar potenciais sítios de eventos off-target que possam causar mutagênese e consequente indução tumoral. Para isso, realizamos a injeção hidrodinâmica de complexos lipossomais de CRISPR/Cas9 em camundongos recém-nascidos. A caracterização geral das formulações apresentou complexos com cerca de 133 nm, e potencial zeta positivo de +43 mV. A biodistribuição dos complexos após a injeção hidrodinâmica ocorreu principalmente no fígado, pulmões e coração, que se tornaram os principais tecidos alvos deste estudo. A análise experimental com base nos potenciais sítios obtidos através de previsões in silico mostrou 0% de indels no fígado e nos pulmões. Concluímos que o conjunto de experimentos demonstrou que a sequência de gRNA escolhida tem potencial para realizar uma edição gênica segura no locus murino ROSA26.