Produção de cromoproteína azul do coral Acropora millepora em vesículas extracelulares em Escherichia coli

Abstract

O vetor sintético pAZUL2.0 foi desenvolvido, caracterizado e projetado para expressão de proteínas recombinantes em vesículas derivadas da membrana celular de Escherichia coli, mais especificamente para a proteína de coloração azul amilCP. Neste contexto, as cromoproteínas têm se destacado como alternativas promissoras aos pigmentos sintéticos, por se tratarem de compostos biológicos mais sustentáveis, com potencial aplicação industrial. Adicionalmente, estudos preliminares indicam que essas proteínas podem apresentar atividade fotoprotetora contra a radiação UVA e UVB, o que sugere possíveis aplicações futuras em formulações cosméticas. Dessa forma, a construção do vetor baseou-se no plasmídeo pUC57, amplamente utilizado em clonagem molecular, ao qual foi inserido um cassete de expressão contendo elementos funcionais básicos para expressão de proteínas; o promotor T7, o sítio de ligação ao ribossomo (RBS), o gene do peptídeo sinal artificial VNp6, para exportação da proteína desejada ao meio extracelular em vesículas e uma cauda de histidina 6xHis. O cassete foi flanqueado por terminadores transcricionais (rrnB T1 e T7Te) e por regiões não codificantes (P3AMOD e P1ATER) para modularidade e intercambialidade em diferentes sistemas de montagem gênica. O gene codificante para a cromoproteína amilCP é naturalmente encontrado em corais da espécie Acropora millepora e foi otimizado para expressão em procariotos. Para avaliar os impactos nas diferentes cepas de E. coli, a transformação do DNA recombinante foi feita por eletroporação em NEB Stable, BL21(DE3), SHuffle® T7 e BL21(DE3)pLysS. A confirmação da inserção correta foi realizada por PCR de colônia, extração de DNA plasmidial e digestões enzimáticas. Os resultados demonstraram sucesso na construção do vetor e na inserção do gene da cromoproteína, com confirmação por meio de padrões de bandas esperados e simulações in silico. No entanto, observou-se baixa eficiência de transformação e viabilidade celular comprometida nos transformantes avaliados, provavelmente devido à uma possível toxicidade da amilCP ou um custo metabólico elevado de sua expressão. Ademais, foi observada a presença de coloração azul em inóculos líquidos mesmo na ausência de indutor, o que indica uma expressão basal do cassete. Conclui-se que, embora o vetor pAZUL2.0 tenha sido funcionalmente construído e validado, a expressão da cromoproteína amilCP comprometeu significativamente o fitness celular das cepas hospedeiras, o quepode ser contornado pela utilização de sistemas livres de células (cell-free), além da substituição da amilCP por genes de menor carga metabólica.

The synthetic vector pAZUL2.0 was developed, characterized, and designed for the expression of recombinant proteins in vesicles derived from the cell membrane of Escherichia coli, specifically for the blue-colored protein amilCP. In this context, chromoproteins have emerged as promising alternatives to synthetic pigments, as they are more sustainable biological compounds with potential industrial applications. Additionally, preliminary studies suggest that these proteins may possess photoprotective properties against UVA and UVB radiation, indicating possible future applications in cosmetic formulations. The construction of the vector was based on the pUC57 plasmid, widely used in molecular cloning, into which an expression cassette was inserted containing the essential functional elements for protein expression: the T7 promoter, a ribosome binding site (RBS), the synthetic signal peptide gene VNp6, intended to direct the target protein to the extracellular medium via vesicles, and a 6xHis histidine tag. The cassette was flanked by transcriptional terminators (rrnB T1 and T7Te) and non-coding regions (P3AMOD and P1ATER) to provide modularity and interchangeability in different genetic assembly systems. The gene encoding the chromoprotein amilCP, naturally found in corals of the species Acropora millepora, was codon-optimized for prokaryotic expression. To assess the impact on different E. coli strains, the recombinant DNA was introduced by electroporation into NEB Stable, BL21(DE3), SHuffle® T7, and BL21(DE3)pLysS strains. Confirmation of correct insertion was performed via colony PCR, plasmid DNA extraction, and enzymatic digestion. The results confirmed the successful construction of the vector and insertion of the chromoprotein gene, as evidenced by expected band patterns and in silico simulations. However, low transformation efficiency and reduced cell viability were observed in the transformed strains, likely due to possible toxicity of amilCP or the high metabolic burden associated with its expression. Additionally, blue coloration was detected in liquid cultures even in the absence of an inducer, indicating basal expression from the cassette. In conclusion, although the pAZUL2.0 vector was successfully constructed and functionally validated, the expression of amilCP significantly compromised host cell fitness. This issue may be mitigated through the use of cell-free expression systems, as well as by replacing amilCP with genes that impose a lower metabolic load.